Peter Parker (Tobey Maguire) har äntligen fått sin drömtjej, Mary Jane Watson (Kirsten Dunst), och hela New York har fått Spider-Man-feber! Men när en mystisk rymd-symbiot förvandlar Spider-Mans kostym till svart, börjar hans mörkaste demoner komma fram – detta förändrar Spider-Man på insidan såväl som på utsidan. Spider-Man måste nu slåss för sitt liv mot en dödlig mix av fiender - Sandman (Thomas Haden Church), Venom (Topher Grace), och den nya Goblin (James Franco) – men också fienden som finns inom honom själv.