Peter Parker (Andrew Garfield), un adolescent marginal, passe ses journées à essayer de résoudre le mystère de son passé et conquérir le cœur de sa bien-aimée au lycée, Gwen Stacy (Emma Stone). En retrouvant une mystérieuse mallette ayant appartenu à son père disparu, Peter commence une enquête qui le conduit chez le Dr Connors, ancien associé de son père. Il y découvrira un terrible secret, qui l'amènera à endosser l'identité de « Spider-Man » et à confronter Le Lézard, l'alter ego diabolique de Connors...
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