Charakterisierung des viralen TAP-Inhibitors ICP47 und Entwicklung nicht-radioaktiver Untersuchungsmethoden

Lars Neumann

чэр 1998 · diplom.de

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Inhaltsangabe:Zusammenfassung: Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit dem Antigenpeptid-Transporter TAP, dem eine Schlüsselrolle in der Immunerkennung infizierter oder entarteter Zellen zukommt. So werden Proteinbruchstücke, die mit Hilfe des Proteasomenkomplexes im Zytosol erzeugt werden von TAP in das endoplasmatische Retikulum gepumpt, wo sie mit MHC-Klasse-I Molekülen assemblieren. Nachdem Transport dieses Komplexes auf die Zelloberfläche tasten zytotoxische T-Lymphocyten die präsentierten Peptide ab und eliminieren Zellen, die Fragmente von zellfremden Proteinen tragen. Im ersten Teil dieser Studie werden neue, nicht-radioaktive Möglichkeiten zur Untersuchung der Peptid-TAP-Wechselwirkung entwickelt. So werden elektronenmikroskopische Analysen mit Goldkörnchen-tragenden Peptiden besprochen und die Nutzung des S-Peptids der Ribonuklease-S oder Luciferin-markierter Peptide diskutiert. Besonders wird auf das Potential von Peptiden eingegangen, die mit Fluoreszenzsonden gekoppelt wurden. So zeigte sich, daß Fluorescein-markierte Peptide sowohl für die Quantifizierung der Peptidbindung und des Peptidtransports als auch zur Untersuchung der räumlichen Struktur der Peptidbindungstasche hervorragend geeignet sind. Im zweiten Teil wird das Herpes-Simplex-Virus Protein ICP47 charakterisiert, das durch die Inhibierung von TAP die Immunerkennung des Virus und somit die Lyse der infizierten Zelle verhindert. Die Wechselwirkung dieses klinisch hoch-relevanten Immunmodulators mit seinem Zielprotein TAP wird ausführlich kinetisch und thermodynamisch analysiert. Dabei wird auf die Speziesspezifität verschiedener Herpes-Simplex-Virus Stämme eingegangen. Darüber hinaus werden strukturelle Besonderheiten, die durch eine Membran-ICP47-Wechselwirkung erzeugt werden, theoretisch und CD-spektroskopisch untersucht. Schließlich wird mit Hilfe von Sequenz-vergleichenden Studien und durch Experimente mit systematisch verkürzten ICP47-Varianten die aktive Domäne des viralen Inhibitors lokalisiert. Neben den wissenschaftlichen Ergebnissen sind zahlreiche für die Biochemie essentielle Techniken beschrieben. So wird das Bakulovirus-Expressionssystem mit den dafür notwendigen Methoden der Insektenzellkultur, Bakulovirusamplifikation und -infektion erläutert. Außerdem werden Mikrosomenisolationsverfahren, Gelektrophorese, reversed phase Chromatographie und Assays zur Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet. Zusätzlich werden Methoden zur Proteinmarkierung, wie die [...]